從PD-1到CART,抗癌新時代的到來

 

《科學》雜志將腫瘤免疫治療列為2013年十大科學突破的首位,并預測2015年重要突破之一是聯合免疫療法。


【免疫檢查點阻斷藥物】


基于免疫檢查點阻斷原理的試驗藥物大獲成功,被稱為2013年度腫瘤醫學界最激動人心的進展。也給廣大病患帶來新希望。這些藥物包括針對PD-1的nivolumab、MK-3475、pembrolizumab,針對PD-L1的MPDL3280A、MEDI4736,針對CTLA4的Ipilimumab,等。

PD-1是程序化死亡受體。PD-L1是程序化死亡配體。兩者在T細胞和腫瘤細胞均有表達。腫瘤細胞通過PD-L1觸發PD-1,導致T細胞的失活。將人單克隆抗體用于封閉PD-1,或封閉PD-L1,結果PD-L1將無法觸發PD-1,從而強化了T細胞的戰斗力。

據報道,免疫檢查點抑制劑的總緩解率為20%左右。與PD-L1表達陰性的患者相比,PD-L1表達陽性的患者的緩解率較高(13%vs36%)。

PD-L1是PD-1的配體,因此抗PD-L1的單克隆抗體是同等重要的免疫檢查點抑制劑。有證據表明抗PD-L1抑制劑的耐受性相比PD-1抑制劑可能會更好。估計原因是PD-1抑制劑封閉了T細胞上的PD-1。PD-1既然是正常的受體,自有存在的理由。現在人為封閉PD-1,在影響癌細胞的同時,也會影響到PD-1的正常生物功能。PD-L1抑制劑針對癌細胞,不會影響到T細胞上PD-1的正常生物功能。

現在探討免疫檢查點抑制劑的特點

這類抑制劑的最主要特點是廣譜性。T細胞只要激活,能攻擊各種癌細胞,因此一種藥對多種腫瘤具有療效。

第二是良好的耐受性。啟動的T細胞具有特異性,只針對癌細胞,完全沒有傳統治療(手術、化療、放療)的殺敵一千,自傷八百的弊端。畢竟T細胞早已在胸腺中學會認識正常細胞,不太會誤傷自己人。至多是殺敵一千,自傷八十吧。

第三是可以長期有效。每2到3星期一次的治療,由于良好的耐受性,可一直持續下去。相比之下,化療、放療由于對正常組織傷害大,難以長期維持。被T細胞殺傷的癌細胞降解后提供了新抗原,保證了過繼免疫的持續應答,形成了良性循環。

接下來探討免疫檢查點阻斷療法的局限性

首先注意到平均緩解率只有20%幾,似乎有70%多的患者未受益。這取決于過繼免疫應答(細胞毒T細胞的免疫應答)是否存在以及應答有多強。可分4種情形。

一是T細胞與癌細胞棋逢對手,難分上下,免疫檢查點阻斷就有可能成為壓垮駱駝的那根稻草。

二是T細胞弱于癌細胞,但相差不太多。免疫檢查點抑制劑仍有可能助T細胞反敗為勝。

三是過繼免疫應答太弱,免疫藥物助陣也無法逆轉戰局。

四是免疫耐受、免疫衰竭,過繼免疫應答不存在或已熄火,T細胞將癌細胞當作了一家人,免疫檢查點阻斷療法是無效的。好比警察不識恐怖分子,給再多的武器也無用。

當然也可能存在第五種情形,過繼免疫應答已非常強大,不用借助外力也能壓制癌細胞。自愈就屬于這類情形,往往被視為奇跡。如果自愈者正好試著某一偏方、食療、功法,多半會被推崇備至,以為仙方神功。這大概是網上瘋傳的眾多偏方、食療、功法的起源吧。

70%多未緩解的患者,要么已經免疫耐受,這是最糟糕的一種情形;要么過繼免疫應答太弱,免疫藥物助陣也無法逆轉戰局。不過,無法逆轉戰局不等于未受益,疾病的進展還是受到了部分阻擊,只是當下醫學手段無法精確檢測出,也無法對比。

從PD-L1表達陽性的患者三分之一多的緩解率可以大致推測總群體里至少有相同比率的患者,無論是陰性陽性,屬于第一、二種情形。陰性導致外來助力打了折扣,影響了治療效果。外因還是要通過內因起作用的。

一個大家都關心的問題是長期使用免疫檢查點阻斷藥物最終會否導致耐藥。目前尚未見到這方面的報道。根據選擇壓力以及癌細胞的異質性,耐藥的可能性或許存在。PD-L1高表達/過表達的癌細胞有較多的機會躲過T細胞的掃蕩,形成免疫逃逸株,逐漸增殖成為腫瘤的主流。需要更多的單克隆抗體來封閉PD-L1。這與PD-L1表達陽性的患者的緩解率較高的臨床結果并不矛盾。同樣是第一種情形,PD-L1表達陽性患者的過繼免疫應答應該強于PD-L1表達陰性患者,才能到達動態平衡。封閉等同量PD-L1之后,強過繼免疫應答能殺傷更多的癌細胞。

最后探討強化免疫檢查點阻斷療法的可能性

最直接的是強化現存的過繼免疫應答。可以通過白介素-2促進免疫效應T細胞的增殖,白介素-12等細胞因子促進T細胞的分化,伽馬干擾素提升免疫細胞的活力,等等。DC-CIK或許也有那么一點作用?

針對免疫衰竭,有報道少量的放化療能造成抗原的大量產生,再次激活過繼免疫應答。類似內毒素的雙鏈RNA,細菌特異的DNA,多糖,脂多糖等等也有可能刺激免疫細胞的陀樣受體釋放白介素-12等細胞因子【1】。

結論

怎樣啟動、強化、檢測過繼免疫應答仍是醫學界的一大難題。如何打破免疫耐受,更是醫學領域難中之難。

免疫系統的機理極其復雜,是一個交叉作用的超級網絡。各種受體、配體、補體,各種抗原、抗體,各種細胞因子,各種免疫細胞,多態HLA分子,以及多個免疫器官相互作用。僅細胞因子就有兩百余種,很多具有雙向調節作用。例如,白介素-2參與正反調控,不僅促進免疫效應細胞如CD8+,同時也促進調節性T細胞的增殖。而調節性T細胞的上調會抑制免疫效應細胞。究竟是促進還是促退,還得看別的因素。這也是早期LAK免疫療法不成功的原因之一。

免疫檢查點阻斷藥物基于過繼免疫應答,可這免疫應答不是我們能掌控的。我們的免疫系統處理外源性病原體效率高,偏偏對腫瘤不是很靠譜。比如,根據危險模型理論【2】,免疫系統多半是不識腫瘤的,因為腫瘤是自己身體里長出來的,屬自家人。如果靠譜,免疫系統就不會坐視單個癌細胞發展到千千萬萬個。單個癌細胞都沒能消滅掉,要對付千千萬萬個癌細胞自然要難上千萬倍。所以每個自愈的都是奇跡。

過繼免疫應答的啟動需要一系列條件。最重要的是要有明確可識的抗原,為第一信號。其次需要T細胞和抗原提呈細胞APC相互刺激產生共刺激信號,為第二信號。根據危險模型理論,針對腫瘤還需要危險信號,為第三信號。可是醫學界尚未找到產生這三種信號的有效手段。此外,某些癌細胞的主要組織相容性復合體MHC表達過低,也會造成免疫細胞找不到腫瘤相關抗原。

嵌合抗原受體T細胞療法CART,繞過了啟動過繼免疫應答這一難關,開創了跨越式發展的醫學史新篇章。

最后提一下,PD-L1表達陰性也不必氣餒,塞翁失馬,焉知非福。有報道,腫瘤細胞PD-L1高表達的患者抗VEGF治療效果不佳,總生存期更短。如此一來,PD-L1陰性的患者用血管生成抑制劑豈不是更有把握了。又有報道【3】,Genentech在分析抗腫瘤PD-L1抗體MPDL3280A的治療結果時有了意外發現腫瘤PD-L1陽性的響應率為38%,而腫瘤浸潤免疫細胞PD-L1陽性的響應率為83%!Genentech的觀點是,抑制免疫應答的不是腫瘤細胞而是在腫瘤微環境中的免疫細胞自身。真有意思!


【嵌合抗原受體T細胞療法CART】


什么是CART

CART的概念是以色列Zelig Eshhar博士上世紀80年代提出的,1989首次開發出嵌合抗原受體T細胞。

CART針對那不怎么靠譜的過繼免疫,引入全新的概念與方法,成功地誘導出抗癌的過繼免疫應答。

首先CART解決了抗原的難題。既然在自然的狀況下免疫系統找不到抗原,那就人為指定一種抗原。考察急性淋巴B細胞白血病的CART療法。淋巴B細胞表面有一個分化抗原CD19,無論是正常B細胞還是癌變B細胞都有表達。選CD19為靶抗原可以確保沒有漏網之魚。

接下來,怎樣確保T細胞能找到CD19靶抗原?這也是CART的核心技術。自然的T細胞肯定不會將CD19當作靶抗原的。CD19表達于正常B細胞,T細胞對CD19耐受。CART將一個抗原受體嵌合到T細胞表面。這抗原受體本質是一種抗體,對CD19有很高的親和性。兩者碰到就會結合,不離不棄。于是,用抗體蛋白聯接定位,T細胞就釘住了癌細胞。所以有一比喻,這抗原受體就像GPS,給T細胞導航,為找到目標提供了保證。

嵌合抗原受體T細胞療法就是嵌合了抗原受體(CAR)的T細胞療法。

那抗體又是怎樣插入進T細胞的?這是通過基因轉染技術實現的。這里轉染的并不是抗體本身而是編碼抗體的基因,也就是說轉染的是DNA。轉染的DNA會編碼抗體然后表達于T細胞表面。

僅僅嵌合了抗體的T細胞療法是第一代CART,解決了靶抗原或第一信號的問題。但是臨床效果差強人意,原因是第二信號即共刺激信號的缺失。沒有共刺激信號T細胞仍然沒法激活,那樣就算釘住了癌細胞也沒有戰斗力。產生共刺激信號需要T細胞和抗原提呈細胞之間的互動。可是抗原提呈細胞也需要第一信號。這樣勢必還要將同樣的抗體嵌合進抗原提呈細胞如DC,過于復雜了。

于是,針對共刺激信號又開發出第二代CART。第二代CART在靶向CD19的基礎上,加入了CD28或CD137,T細胞上的共刺激受體。T細胞的信號域包括:CD3ζ(T細胞抗原受體信號轉導的組成成分)——CD28,或CD3ζ——CD137。免疫應答的貫序可表述為:CD19激活抗體,抗體激活CD28(CD137),CD28(CD137)激活CD3ζ。可以說,第二代CART同時解決了第一信號和第二信號,不再依賴不怎么靠譜的腫瘤相關抗原,不再依賴抗原提呈細胞,也不必擔心MHC的低表達。

第三代CART的特點是在CD28之后又加入了共刺激分子蛋白OX40或4-1BB(4-1BB就是CD137)。這兩種共刺激分子蛋白可進一步活化T細胞,延長生存期。三代CART技術的演化反映了共刺激分子的重要作用。

在此小結一下。嵌合抗原受體CAR能與靶抗原高親和性結合而不受中樞耐受的影響,這一特性使得CAR的免疫治療能夠克服以往免疫治療的大部分缺陷。因為大部分CAR由單鏈受體來源的胞外域組成,因此能夠以不依賴MHC的方式識別腫瘤表面的靶抗原,克服了腫瘤逃逸機制,如MHC表達下調或抗原呈遞裝置功能缺陷。這一特性使得CAR表達細胞去攻擊低免疫原性的腫瘤。

急性淋巴B細胞白血病的CART療法獲得了驚人的90%-100%的響應率,長期有效,不少病患完全緩解也就是臨床痊愈了。更何況,這些入組CART的病患都是化療失敗、骨髓移植后復發等就快走投無路重病患。CART將會成為人類歷史上偉大里程碑:真正治愈癌癥的方法。

CART療法的安全性與對策

推廣CART療法的主要障礙來自脫靶效應。像CD19不是腫瘤的靶點,而是B細胞本身的靶點。腫瘤細胞清除掉的同時B細胞也被清除掉了。這已不是殺敵一千,自傷八百。更不是殺敵一千,自傷八十。而是寧可錯殺一千,絕不放過一個。好在患者沒有B細胞照樣可以生存,只要定期輸入丙種免疫球蛋白即可。

只要靶點不是百分百腫瘤特異性,就會有脫靶效應,這是CART副作用的主要來源。據報道,一例以HER2為靶抗原針對結腸癌的第三代CART治療,病人輸入CART十五分鐘后出現呼吸窘迫,五天后死亡。檢測到高水平的細胞因子并發現CART細胞浸潤肺組織。一個解釋是靶抗原在正常肺組織中有表達。

為了提高CART治療安全性和有效性,一個保守的劑量遞增方法是在2天或以上分散T細胞輸入劑量,不斷監測毒性跡象,阻止可能誘發大規模反應的進一步T細胞輸入。用單克隆抗體封閉靶抗原來緩解脫靶反應也是必要時的一種選擇。最近還提出了引入自殺基因的方案,必要時立即啟動CART自殺,目前在III期臨床試驗。

CART療法另一副作用是細胞因子風暴。據報道早期CART治療時60%的病患要住ICU。現在用劑量遞增方法可大大減少細胞因子風暴的產生。

肺的CART療法

到目前為止大多數臨床CART引人注目的結果都來自治療血液疾病。針對實體瘤的CART臨床也開始起步【4】【5】。

重中之重是找到一個合適的靶抗原。一個合適的靶抗原最好是只表達于腫瘤,也就是腫瘤特異性抗原。但是迄今為止肺腫瘤中未找到這樣的特異性靶抗原。這也是過去十年肺腫瘤疫苗接二連三走麥城的主要原因。也說明肺癌細胞更容易逃避免疫監視。

于是只能退而求其次尋求腫瘤相關性抗原。我們寄希望于靶抗原在腫瘤細胞中高表達,在正常細胞中低表達。目前所發現的腫瘤相關抗原絕大多數均是機體自身的成分,只是在正常情況下正常組織不表達或微量表達,或表達局限在某一(幾)類組織或細胞。而腫瘤細胞中過量表達。因此,這類免疫細胞治療也存在發生自身免疫反應的風險。

一個能想到的靶抗原是癌胚抗原CEA。不少肺癌患者CEA遠高于正常值,說明癌胚抗原多半高表達。在自然情況下,高表達的癌胚抗原難以啟動過繼免疫應答。這是因為癌胚抗原曾在嬰兒體內高表達過,容易造成免疫細胞對癌胚抗原終身耐受。有了CART,免疫耐受不再成為問題。但不知什么原因,以癌胚抗原為靶抗原的CART臨床試驗目前只有乳癌與腸癌。或許,癌胚抗原高表達在乳癌與腸癌患者中比率更高。

另一個我們能想到的是EGFR(HER1),我們的老朋友。由于EGFR在眾多器官組織中表達,我們希望EGFR在腫瘤細胞中的表達遠高于正常細胞,CART就有施展空間。將EGFR表達分成四級:陰性、弱陽性、中陽性、強陽性。EGFR基因突變不一定EGFR就會陽性表達。有意思的是,據報道【6】EGFR表達陽性的比例遠高于EGFR基因突變,130例NSCLC中突變率為29.2%。EGFR陽性率為67.7%。因此,EGFR野生的也有很高的幾率表達陽性,有希望接受CART治療。值得注意的是,15%的正常組織呈弱陽性,而三分之一的癌變組織呈陰性。因此脫靶的可能性存在。接受CART治療前做免疫組化,或許應該同時檢測癌變組織和正常組織。如果正常組織呈弱陽性,癌變組織最好要呈強陽性。

HER2也是一個可能的靶抗原。由免疫組化確定表達水平,以此決定是否可上CART療法。

接下來介紹肺CART治療的醫院。令人意外的是,能找到的基于HER1和HER2的肺CART臨床試驗都在301醫院,另有一家用HER2【5】。部隊醫院真是敢想敢干,走在世界前列。臨床設計的主要終點是安全性,次要終點是抗瘤應答率。根據美國臨床試驗注冊官網【4】描述: anti-EGFR-CAR (coupled with CD137 and CD3 zeta signalling domains) vector-transduced autologous T cells on days 0, 1, and 2 in the absence of unacceptable toxicity,至少可以確定是第二代CART,分三天回輸經基因工程轉染的T細胞以確保無毒性。 

覺得301的臨床實驗的設計較合理: 專注靶抗原的表達水平而不拘泥于特定的病理組織形態。因此,301醫院的CART-EGFR同時面向肺癌、腸癌、卵巢癌、肝癌等陽性表達的實體瘤。以此類推,CART-CEA也可如此設計,不限于某一類癌癥,只要CEA表達陽性即可CART治療。

CART同樣存在長期使用會否導致最終失效的疑問。根據選擇壓力以及癌細胞的異質性,有可能出現EGFR低表達/無表達的癌細胞變異株,有較多的機會躲過T細胞的掃蕩,形成免疫逃逸株。不過能否增殖成為腫瘤的主流,還要看其他因素。比如是否同時存在其他抗原激活的過繼免疫應答,有否遭遇固有免疫效應細胞如NK細胞和巨噬細胞,等。隨著新靶抗原CART的不斷開發,我們還會有更多的選擇,例如以HER2、CEA、PDL1、VEGFR等為靶點的CART。一般一個癌細胞增殖到一公分大小要5-10年時間。5年后,一定會有更神奇的抗癌藥、抗癌療法問世。

展望

當下CART研究熱火朝天,包括尋找新靶抗原,CAR抗體結構的優化設計,基于安全性考量的多靶點T細胞技術,第4代細胞免疫技術CART(如在CAR結構的基礎上,增加表達IL-12的元件),共刺激結構域的組合,趨化因子受體和CAR的組合表達,等。

《科學》預測2015年重要突破之一是聯合免疫療法。聯合免疫療法是目前醫學界探討的焦點。將多種療法混合搭配:例如,整合兩種新的免疫療法例如CART和免疫檢查點抑制劑的聯合,或是聯合一種免疫療法與一種靶向藥物例如CART和小分子靶向藥物的聯合、以及CART與放射療法或化學療法相結合。但聯合免疫療法的潛在毒性依然是一個值得關注的問題。

那么,對癌癥患者及家屬說一句:利用靶向藥延長生存期,等待真正的革命性治療出現。堅持就是勝利!誰活著誰就看得見!


【1】 Inside, outside, upside down: damage-associated molecular-pattern molecules (DAMPs) and redox, Trends in Immunology 28, 429-436, 2007.
【2】 The Danger Model: A renewed sense of self, Science, 296, 301-305, 2002.
【3】 Genentech’s challenge to the classical hypothesis on immune evasion, Nature, 515(7528), 563-567, 2014.
【4】 https://clinicaltrials.gov/ct2/r ... t&Search=Search
【5】 http://en.wikipedia.org/wiki/Chimeric_antigen_receptor
【6】 非小細胞肺癌的EGFR表達與EGFR基因突變的比較, 中國實驗診斷學, Vol 13, No.2, 2009.

(本文原作者elexujx)

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